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肝硬化患者外周血TLR、CD14表達(dá)及其與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系
作者：楊少奇， 王莉， 黃睿， 楊芝紅， 楊 力
作者單位：(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750004; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，銀川 750004)
【摘要】
目的 探討肝硬化患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)表面CD14、TOLL樣受體(TLR2、TLR4)的表達(dá)情況及其與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系。
方法 分別采用顯色基質(zhì)鱟試劑試管法和流式細(xì)胞術(shù)檢測50例肝硬化患者和30例健康志愿者外周血內(nèi)毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)。
結(jié)果 肝硬化患者外周血內(nèi)毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)高于正常對照組(P<0.05);肝硬化合并腹水患者外周血內(nèi)毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)高于肝硬化無腹水患者(P<0.05);肝硬化患者外周血內(nèi)毒素濃度與PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。
結(jié)論 肝硬化患者外周血內(nèi)毒素濃度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)均高于正常人，內(nèi)毒素及內(nèi)毒素受體CD14、TLR2、TLR4協(xié)同作用介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，可能導(dǎo)致肝硬化患者病情進(jìn)一步加重。
【關(guān)鍵詞】 肝硬化;內(nèi)毒素血癥;Toll 樣受體
內(nèi)毒素血癥是肝硬化患者發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至致死的重要原因之一，至今其預(yù)防和治療效果不甚理想。內(nèi)毒素的致病機(jī)制主要是依賴內(nèi)毒素相關(guān)受體介導(dǎo)的，Toll受體2(TLR2)、Toll受體4(TLR4) 、CDl4是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素相關(guān)受體[1]。本研究通過檢測肝硬化患者外周血血漿內(nèi)毒素濃度及單個核細(xì)胞表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)，進(jìn)一步明確TLR的表達(dá)與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 研究對象
寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2008年12月1日-2009年3月1日收住院的乙肝肝硬化患者50例，其中男37例，女13例，年齡25-75 歲，平均(50.62±14.16)歲。所有乙肝肝硬化患者病例均符合2000年西安會議《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。肝功能分級采用Child-Pugh分級法，其中Child-Pugh A級28例，B級16例，C級 6例。并將患者根據(jù)有無腹水分兩組，其中肝硬化合并腹水者27例，無腹水者23例。
同期隨機(jī)選擇30例健康人作為正常對照，其中男21例，女9例，年齡23～80 歲，平均(52.26±14.46)歲。
1.2 標(biāo)本來源
80例研究對象清晨空腹采集外周血3mL。其中2mL外周血注入抗凝管中，流式細(xì)胞技術(shù)檢測備用;1mL外周血注入加有1mL血液抗凝劑的無熱原試管中，制成二倍稀釋液。離心取上清液待檢內(nèi)毒素濃度。
1.3 檢測方法
采用顯色基質(zhì)鱟試劑試管法檢測內(nèi)毒素濃度(東方鱟鱟試劑由廈門市鱟試劑實驗廠有限公司生產(chǎn));采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC表面TLR2、TLR4、CD14的表達(dá)(CD14抗體，TLR2、TLR4檢測試劑，檢測結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度的幾何均數(shù)表示。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
所有實驗數(shù)據(jù)均由自動分析后獲取，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)庫并分析。計量資料參數(shù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗;多個樣本均數(shù)比較采用方差分析;兩變量關(guān)聯(lián)性采用Pearson相關(guān)性分析。
2 結(jié)果
2.1 外周血內(nèi)毒素濃度檢測結(jié)果
經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，肝硬化患者外周血內(nèi)毒素濃度(0.043±0.023)EU·mL-1顯著高于正常對照組(0.027±0.018)EU·mL-1(P<0.05);肝硬化合并腹水患者內(nèi)毒素濃度(0.055±0.033)EU·mL-1顯著高于肝硬化無腹水患者(0.030±0.020)EU·mL-1(P<0.05)。
2.2 BMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)
經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理，肝硬化患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05);肝硬化腹水患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)顯著高于肝硬化無腹水患者組(P<0.05);肝硬化無腹水患者組與正常對照組有升高趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1(如圖1-4，見封3)。表1 各組間PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)肝硬化組與對照組比較*P<0.05;腹水組與無腹水組比較#P<0.05。
2.3 外周血內(nèi)毒素濃度與PBMC表面 CD14、TLR2、TLR4表達(dá)的相關(guān)性
通過Pearson相關(guān)性分析，肝硬化患者外周血內(nèi)毒素濃度、PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性。內(nèi)毒素濃度與CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.369、0.461、0.521，P<0.05);CD14與TLR2、TLR4呈正相關(guān)(r分別為0.481、0.498，P<0.05);TLR2與TLR4呈正相關(guān)(r=0.53，P=0.002)。
3 討論
肝硬化患者由于存在腸道細(xì)菌菌群紊亂、門體分流等因素容易導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生，內(nèi)毒素(Lipopolysaccaride，LPS)激活kupffer細(xì)胞等產(chǎn)生 TNF-α、IL-6等炎性因子，從而加重肝臟及其他相關(guān)臟器的損害[2]。內(nèi)毒素血癥與肝硬化患者的自發(fā)性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病等并發(fā)癥的產(chǎn)生有關(guān)。
本研究采用顯色基質(zhì)鱟試劑(試管法)檢測肝硬化患者內(nèi)毒素濃度，結(jié)果表明：與健康人比較，肝硬化患者內(nèi)毒素水平升高，肝硬化合并腹水患者組內(nèi)毒素濃度高于肝硬化無腹水患者組。說明肝硬化患者存在內(nèi)毒素血癥，并且內(nèi)毒素與肝硬化發(fā)病及病情進(jìn)展相關(guān)。肝硬化患者腸道通透性增加，腸道菌群產(chǎn)生的內(nèi)毒素通過血循環(huán)進(jìn)入肝臟及外周血，內(nèi)毒素與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，通過內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起下游的炎癥因子分泌，炎癥因子可能會引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生或肝硬化進(jìn)一步加重。內(nèi)毒素可通過肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，內(nèi)毒素本身又可能直接加重肝臟組織的損傷。肝硬化腹水的形成與內(nèi)毒素血癥逐漸加重有關(guān)，進(jìn)一步說明內(nèi)毒素與肝硬化發(fā)病及疾病進(jìn)展相關(guān)。
TLR2、 TLR4、 CD14等是在宿主抗病原微生物的免疫應(yīng)答中起重要作用的內(nèi)毒素相關(guān)受體分子，是內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)[3]。其中TLR2、TLR4 是內(nèi)毒素信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“門戶蛋白”。TLR2、TLR4 、CDl4大量表達(dá)于外周血單個核細(xì)胞表面。研究顯示TLR的表達(dá)與肝硬化患者內(nèi)毒素血癥及炎性因子的產(chǎn)生相關(guān)[4-6]。
本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乙肝肝硬化患者的表達(dá)明顯高于正常人，并且腹水患者PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)高于無腹水患者，內(nèi)毒素濃度與CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)成正相關(guān)。本研究提示CD14、TLR2、TLR4 在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用，其原因可能是肝硬化患者內(nèi)毒素水平升高，大量的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，與單個核細(xì)胞接觸，引起單個核細(xì)胞對內(nèi)毒素的應(yīng)激和敏感度增加，導(dǎo)致 TLR表達(dá)的升高，TLR識別內(nèi)毒素，啟動炎癥信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在肝纖維化和肝硬化的發(fā)病中起著重要作用[7]。
本研究中，肝硬化患者隨著PBMC 表面CD14的表達(dá)增加，TLR2 顯著增加。隨著CD14的表達(dá)增加，TLR4 也顯著增加，進(jìn)一步提示CD14、TLR2、TLR4能夠介導(dǎo)多種重要病原體成分與細(xì)胞的反應(yīng)，是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子[8-9]。
綜上所述，內(nèi)毒素及內(nèi)毒素受體CD14、TLR2、TLR4協(xié)同作用介導(dǎo)機(jī)體炎癥的反應(yīng)過程，可能參與肝纖維化或?qū)е赂斡不M(jìn)一步加重。本研究為肝硬化的臨床治療提供新的思路和策略，從減少內(nèi)毒素的角度，或阻斷內(nèi)毒素信號傳導(dǎo)途徑，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，將有可能改善或延緩疾病的進(jìn)程。隨著 Toll 樣受體與肝硬化研究的進(jìn)一步深入，針對 Toll 樣受體靶向調(diào)節(jié)的藥物將對肝硬化的臨床治療開辟新的方向[10]。
參考文獻(xiàn)（略）
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