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LAL試驗快速檢測肉品細(xì)菌污染程度及鮮度的研究
?！≌?王登臨,董瑞鵬,楊紅巖,張 蕾
(甘肅省動物檢疫總站,甘肅蘭州730030)
[摘要]
對不同鮮度的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和魚肉進行活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測定,并與LAL試驗(鱟變形細(xì)胞溶解物試驗)進行平行對比研究,證實肉品的鮮度與其細(xì)菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性。應(yīng)用LAL試驗可在短時間(1～ 2小時)內(nèi)快速判定肉品的細(xì)菌污染程度及鮮度,比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)法大大縮短了時間,適合現(xiàn)場大批量肉品細(xì)菌污染程度及鮮度的快速檢測。
關(guān)鍵詞: 肉品; 細(xì)菌污染; LAL試驗; 快速檢測
中圖分類號: S852.61 文獻標(biāo)識碼: A 文章編號:1008_0589(2002)04_0304_06
Rapid Determination of Bacterial Contamination and Freshness of Meat by LAL TestWUZheng,WANG Deng_lin,DONG Rui_peng,YANG Hong_yan,ZHANG Lei(Gansu Provincial Animal Quarantine Station 730030,China)Abstract: Three different freshness samples of pork,beef,mutton,chicken and fish were examined for the numbers of total viable cells,gram_negative organisms,colifrom groups and the value of TVB_N.The resultswere comparedwith those of LALtest(limulus amoebocyte lysatetest).A positive correlationwas observed among the total viable cells,gram_negative organisms and LALindexes. It indicated that LALtest in-dex can be used to determine the bacterial contamination and freshness of the meat rapidly.
Key words: Meat;Bacterial contamination;LALtest;Rapid determination
肉品的衛(wèi)生質(zhì)量關(guān)系到廣大人民群眾的食肉安全,而肉品細(xì)菌污染程度是反映其衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)?？焖贉?zhǔn)確檢測肉品細(xì)菌污染程度及鮮度,保證廣大消費者吃上“放心肉”,是動物檢疫機構(gòu)和衛(wèi)生部門亟待解決的問題。目前,國內(nèi)檢測肉品新鮮度的主要方法是感官鑒定和實驗室揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測定。感官鑒定的不足之處是結(jié)果不易量化,存在主觀性和片面性;TVB_N測定變化有時不敏感,肉品變質(zhì)程度與肉品中TVB_N含量變化呈非正相關(guān)[1]。肉品細(xì)菌污染程度的檢測是判定肉品鮮度的一種準(zhǔn)確、客觀的方法,常用的為細(xì)菌活菌總數(shù)培養(yǎng)計數(shù)法和大腸菌群數(shù)測定法,但檢驗一個樣品至少需用48小時,費時費力,很不適應(yīng)于當(dāng)今快速肉品消費市場的檢測[1]。
細(xì)菌的快速檢測,是指在檢驗樣品的過程中,無需進行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗等項目的檢驗,而是利用一定的方法在幾小時甚至更短的時間內(nèi)從樣品中直接確定是否有細(xì)菌、細(xì)菌代謝產(chǎn)物存在,定性、定量,以達到對細(xì)菌污染程度進行判定的目的。國外對肉品中細(xì)菌快速檢測已建立了如基因探針檢驗、氣相色譜及免疫酶等多種方法,但這些方法主要用于一些特異性病原菌的檢測,很難全面反映肉品細(xì)菌的污染程度,且所需試劑昂貴,設(shè)備要求高,未能得到廣泛應(yīng)用。
肉品細(xì)菌污染主要是由畜禽屠宰加工過程中革蘭氏陰性腸道細(xì)菌所致。革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁中含有特殊成分—脂多糖,即為革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素。鱟血細(xì)胞內(nèi)含有可凝蛋白、B因子、凝固酶原等蛋白凝固因子,內(nèi)毒素同鱟試劑反應(yīng)可形成肉眼可見的凝膠。國外學(xué)者已對利用LAL試驗快速檢測肉品細(xì)菌污染程度進行了一些研究[2,3]。國內(nèi)一些研究人員已把LAL試驗用于食品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測定[4],但在檢測肉品細(xì)菌污染程度及新鮮度方面的應(yīng)用還未見報道。
1 材料和方法
1.1 鱟試劑 靈敏度為2EU/ml,由廈門鱟試劑廠提供,批號為980708和981103。每批使用前按說明用內(nèi)毒素陽性標(biāo)準(zhǔn)品測定其靈敏度。
1.2 鱟試劑溶解水及稀釋液 鱟試劑溶解水為廈門鱟試劑廠生產(chǎn)的無熱原水;稀釋液為LAL試驗檢測陰性的注射用生理鹽水。
1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基及化學(xué)試劑 營養(yǎng)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂均為成品培養(yǎng)基;所用化學(xué)試劑均為分析純級。
1.4 試驗肉品 豬肉:市場采集的一級鮮度肉28份,二級鮮度肉2份;人工二級鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉11份;牛肉:市場采集的一級鮮度肉5份;人工二級鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉3份;羊肉:市場采集的一級鮮度肉3份;人工二級鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;雞肉:市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;魚肉(淡水魚):市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉2份,人工變質(zhì)肉2份(人工二級鮮度和人工變質(zhì)肉是將新鮮肉在室溫下或在37℃恒溫箱內(nèi)放置一定時間后獲得)。
1.5 LAL試驗方法 將鱟試劑安瓿打開,加入0.1ml鱟試劑溶解水使凍干物充分溶解,然后加入等量的待檢肉樣稀釋液,搖勻置37± 0.5℃恒溫水浴鍋中靜置60± 2分鐘,取出后觀察結(jié)果。同時設(shè)陰性對照、陽性對照及抑制對照。鱟試劑凝固,呈膠凍狀,倒轉(zhuǎn)180度凝塊不變形、不流動判為陽性。以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的肉樣稀釋液最高稀釋倍數(shù)計算LAL指數(shù)(為使鱟試劑發(fā)生凝固的肉樣稀釋液10倍稀釋的最高稀釋度指數(shù))及肉毒素含量。
1.6 肉樣處理和稀釋 在肉樣的精瘦肉處,從約4cm2大小范圍內(nèi)由表層向深層取5g肉,置滅菌燒杯中剪碎,加入45ml生理鹽水,放在磁力攪拌器上攪拌10～ 15分鐘,即成1∶10的肉浸液。吸取肉浸液1ml加入裝有9ml生理鹽水的試管中,充分混勻,即成1∶102稀釋液。依據(jù)肉樣新鮮程度(感官判定)依次稀釋至1∶105～ 1∶108。制備的稀釋液同時用于微生物學(xué)試驗及LAL試驗。
1.7 新鮮度鑒定及TVB_N測定 按GB5009.44_85《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》進行。
1.8 活菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)測定 按GB4789.2_84和GB4789.3_84《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗》進行。
1.9 革蘭氏陰性菌數(shù)測定 選擇3個稀釋度肉樣稀釋液,接種伊紅美藍瓊脂平板,每個稀釋度接2個平板,每個平板接種0.2ml,搖勻后37℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)生長的菌落。
1.10 LAL指數(shù)與細(xì)菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_N值相關(guān)性對比分析 按生物統(tǒng)計學(xué)原理計算相關(guān)系數(shù)(r),分析LAL指數(shù)與其他試驗數(shù)值之間的相關(guān)程度。
2 結(jié) 果
2.1 肉品感官鑒定、TVB_N和微生物學(xué)指標(biāo)測定及LAL試驗 由表1～ 5可見,不同種類、不同新鮮度的肉樣88份,隨著肉品新鮮度的降低,活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及大腸菌群數(shù)對數(shù)值均相應(yīng)升高,LAL指數(shù)和肉品內(nèi)毒素含量也都相應(yīng)升高;TVB_N值在豬肉、牛肉和羊肉也都出現(xiàn)相應(yīng)變化;不同新鮮度之間的各數(shù)值(除雞魚肉TVB_N值)有顯著差異(p< 0.01)。同等鮮度牛、羊肉TVB_N值、活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)相近,無顯著差異(p> 0.05);但不同鮮度之間各數(shù)值有顯著的差異(p< 0.01)。因此,牛肉和羊肉可用同一指標(biāo)進行判定。
2.2 LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群及TVB_V值相關(guān)性對比分析 用生物統(tǒng)計學(xué)原理計算相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果見表6。LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_V值的相關(guān)系數(shù)(r)均值分別為0.955、0.948、0.813和0.363;與其相關(guān)性依次為活菌總數(shù)>革蘭氏陰性菌數(shù)>大腸菌群數(shù)> TVB_V值。
參考文獻（略）
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